Rotâmeros em Nitrosaminas

Na indústria farmacêutica, a detecção e quantificação de impurezas como as nitrosaminas relacionadas a substâncias ativas (NDSRI) é crucial para garantir a segurança dos medicamentos.

Um fenômeno pouco discutido, mas que pode complicar significativamente as análises, é a presença de rotâmeros em nitrosaminas. Esses conformeros, resultantes da rotação molecular, podem levar a erros em métodos cromatográficos, afetando a precisão da quantificação.

Neste post, exploraremos em detalhes o que são rotâmeros, como eles se formam em nitrosaminas, suas interferências em análises e como identificar quando uma nitrosamina apresentará esse comportamento. Com base em evidências científicas, oferecemos insights práticos para profissionais da área, alinhados aos serviços de consultoria analítica da BizaLumière.

O Que São Rotâmeros?

Rotâmeros, ou conformeros rotacionais, são isômeros conformacionais que diferem apenas pela rotação ao redor de uma ligação simples em uma molécula. Ao contrário dos isômeros constitucionais ou estereoisômeros, os rotâmeros não envolvem mudanças na conectividade atômica, mas sim na orientação espacial dos grupos funcionais. Eles existem em equilíbrio dinâmico, com barreiras de energia de rotação que determinam sua estabilidade relativa.

Em química orgânica, rotâmeros são comuns em moléculas com ligações C-C ou N-N, onde a rotação é restringida por interações estéricas ou eletrônicas. Por exemplo, em compostos como o Butano, os rotâmeros gauche e anti são bem conhecidos. A energia térmica (kT) permite a interconversão entre esses conformeros, mas em condições analíticas, como em cromatografia, eles podem ser resolvidos como picos separados se a barreira de rotação for alta o suficiente.

Conforme descrito em "Conformational Analysis of Organic Compounds" (Eliel et al., 2010), rotâmeros são definidos por barreiras de rotação tipicamente entre 1-10 kcal/mol, permitindo interconversão rápida em temperaturas ambientes, mas potencialmente separáveis em técnicas analíticas.

Formação de Rotâmeros em Nitrosaminas

Nitrosaminas são compostos da forma geral R1R2N-N=O, onde o grupo nitroso (-N=N=O) é planar e linear. A ligação N-N (nitro-amina) é uma ligação simples, permitindo rotação. Em muitas nitrosaminas, especialmente aquelas com grupos alquila volumosos (como N-nitrosodimetilamina, NDMA, ou N-nitrosodiisopropilamina, NDIPA), a rotação ao redor da ligação N-N pode gerar rotâmeros distintos.

Mecanismo de Formação

• Estrutura Molecular: O grupo nitroso é planar devido à ressonância, mas a ligação N-N permite rotação. Grupos R1 e R2 podem ser simétricos ou assimétricos, influenciando a barreira de rotação. Por exemplo, em nitrosaminas simétricas (R1 = R2), os rotâmeros podem ser idênticos, mas em assimétricas, eles diferem em energia.

Fatores que Favorecem a Formação:

• Temperatura: Em análises cromatográficas, temperaturas elevadas (como em GC-MS) podem estabilizar rotâmeros, enquanto em LC-MS, solventes polares podem influenciar o equilíbrio.

• Solventes: Em soluções orgânicas ou aquosas, a solvatação pode baixar barreiras de rotação, permitindo a observação de múltiplos conformeros.

• Energia de Ativação: Barreiras típicas para rotação em nitrosaminas são de 5-15 kcal/mol, dependendo da substituição. Estudos mostram que em NDMA, a barreira é baixa (~5 kcal/mol), mas em nitrosaminas cíclicas, como aquelas em heterociclos, pode ser maior.

Em um estudo publicado no Journal of the American Chemical Society (Vol. 142, 2020), pesquisadores usaram espectroscopia NMR para demonstrar que nitrosaminas como N-nitrosopiperidina exibem rotâmeros devido à rotação N-N, com barreiras calculadas via DFT (Density Functional Theory) em torno de 10 kcal/mol.

Métodos de Identificação e Caracterização de Rotâmeros

Para distinguir e analisar rotâmeros em nitrosaminas, é necessário empregar métodos precisos e complementares. Técnicas avançadas permitem obter dados sobre conformações moleculares, dinâmica rotacional e interações químicas, fundamentais para compreender as propriedades e o comportamento dessas moléculas.

Técnicas de Espectroscopia

A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma das ferramentas mais importantes para identificar rotâmeros, pois revela diferenças no ambiente químico dos núcleos atômicos entre conformações. O uso de espectros 1D e 2D auxilia no mapeamento de interações espaciais e na distinção de rotâmeros por seus tempos de relaxação e deslocamentos químicos.

Experimentos 2D como NOESY e ROESY são particularmente úteis para detectar proximidades espaciais entre núcleos, ajudando a diferenciar rotâmeros que variam apenas na orientação relativa de grupos funcionais.

Além disso, a RMN variável em temperatura (VT-NMR) permite observar a interconversão entre rotâmeros em diferentes temperaturas, possibilitando o cálculo das barreiras de energia rotacional (ΔG‡) e fornecendo informações termodinâmicas e cinéticas complementares.

Em amostras cristalinas ou semicristalinas, a RMN de estado sólido pode ser empregada para distinguir rotâmeros no estado sólido, revelando interações locais e orientações moleculares que não são detectáveis em solução.

Os espectros de infravermelho (IV) também contribuem para a identificação de rotâmeros, detectando variações nas vibrações de ligação causadas por mudanças conformacionais. Já as técnicas de espectrometria de massas (MS/MS) auxiliam na confirmação estrutural, oferecendo alta sensibilidade e especificidade na análise de nitrosaminas.

Cristalografia de Raios X

A cristalografia de raios X fornece estruturas tridimensionais precisas de rotâmeros no estado sólido, permitindo visualizar a orientação relativa de grupos funcionais, ângulos de ligação e outros parâmetros estruturais essenciais. Esse método é especialmente útil quando os rotâmeros apresentam estabilidade suficiente para formar cristais.

A resolução obtida permite comparar dados experimentais com modelos teóricos e espectroscópicos, validando hipóteses sobre conformação e estabilidade. Assim, a cristalografia serve como uma base estrutural sólida para a interpretação dos resultados espectroscópicos e computacionais.

Cálculos Computacionais

Simulações teóricas desempenham papel crucial na caracterização de rotâmeros. Métodos quânticos, como a Teoria do Funcional da Densidade (DFT), permitem prever energias relativas, barreiras rotacionais e geometrias otimizadas dos diferentes conformadores, possibilitando estimar sua estabilidade e população.

Além disso, técnicas de dinâmica molecular (MD) simulam a evolução temporal das conformações sob condições reais de temperatura e solvente, fornecendo informações sobre a frequência e a estabilidade relativa dos rotâmeros ao longo do tempo.

Modelos computacionais ajudam ainda a interpretar resultados experimentais, correlacionando espectros com estruturas, e fornecem dados detalhados sobre superfícies de energia e interações intramoleculares relevantes à dinâmica rotacional das nitrosaminas.

Fatores que Influenciam a Formação de Rotâmeros em Nitrosaminas

A formação de rotâmeros em nitrosaminas depende diretamente da estrutura molecular e das condições externas que afetam a estabilidade e a liberdade de rotação das ligações químicas. Fatores como impedimentos espaciais, ambiente químico e interações internas desempenham papéis determinantes.

Efeitos Estéricos

O impacto dos grupos volumosos próximos às ligações é decisivo para restringir ou permitir a rotação de partes da molécula. Grupos maiores criam barreiras físicas que limitam a flexibilidade, resultando em rotâmeros distintos.

Esses efeitos estéricos influenciam tanto a velocidade quanto a estabilidade das conformações rotacionais. Moléculas com substituintes volumosos próximos ao nitrogênio tendem a formar rotâmeros mais estáveis, pois a rotação completa torna-se energeticamente desfavorável.

No contexto das nitrosaminas, essas limitações conformacionais podem afetar toxicidade, reatividade química e mecanismos de degradação, uma vez que diferentes rotâmeros podem apresentar comportamentos distintos.

Influência do Meio

O ambiente químico onde a nitrosamina se encontra afeta significativamente a formação e a estabilidade dos rotâmeros. Fatores como tipo de solvente, pH, temperatura e presença de agentes químicos alteram o equilíbrio conformacional.

Em meios ácidos, por exemplo, a protonação ou formação do íon nitrosônio (NO⁺) modifica a distribuição eletrônica, restringindo ou facilitando a rotação ao redor da ligação N–N.

Temperaturas mais elevadas aumentam a energia disponível, permitindo a superação das barreiras estéricas e promovendo a interconversão entre rotâmeros. Já solventes com diferentes polaridades influenciam as interações intermoleculares, alterando a orientação espacial e a estabilidade relativa das conformações.

Interações Intramoleculares

Dentro da molécula, ligações de hidrogênio internas, dipolos e forças de Van der Waals podem estabilizar determinadas conformações e impedir a rotação livre. A presença de átomos altamente eletronegativos próximos gera dipolos que atraem ou repelem regiões específicas da molécula, fixando um rotâmero em detrimento de outro.

Em nitrosaminas, essas interações intramoleculares controlam a distribuição eletrônica e influenciam a energia relativa dos rotâmeros, afetando propriedades críticas como reatividade, estabilidade térmica e tempo de vida dos compostos.

A caracterização detalhada dos rotâmeros em nitrosaminas é essencial para compreender suas propriedades químicas e biológicas, incluindo reatividade, estabilidade e potencial toxicológico.

A integração de técnicas espectroscópicas (RMN, IV, MS), métodos estruturais (cristalografia e RMN de estado sólido) e abordagens computacionais (DFT, dinâmica molecular) fornece uma visão abrangente e precisa da estrutura, dinâmica e comportamento conformacional dessas moléculas complexas.

Interferências em Análises de Quantificação de Nitrosaminas

Rotâmeros podem causar sérias interferências em métodos analíticos usados para quantificar nitrosaminas, como cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) e cromatografia líquida de alta eficiência com espectrometria de massas (LC-MS/MS). Esses métodos são essenciais para detectar NDSRI em medicamentos, conforme diretrizes da FDA, EMA e Anvisa.

Como Eles Interferem

• Separação de Picos: Em cromatografia, rotâmeros com barreiras de rotação suficientes (>10 kcal/mol) podem eluir como picos separados, levando a uma subestimação ou superestimação da concentração. Por exemplo, se uma nitrosamina apresenta dois rotâmeros em proporções 1:1, o pico único esperado pode dividir-se, resultando em quantificação incorreta.

• Sensibilidade e Especificidade: Em GC-MS, temperaturas de injeção elevadas podem promover interconversão, mas em LC-MS, solventes podem estabilizar conformeros, causando picos duplicados. Isso afeta o limite de detecção (LOD) e quantificação (LOQ), que devem estar abaixo de 30 ng/dia para nitrosaminas, conforme AI (Acceptable Intake) da EMA.

• Exemplos Práticos: Em análises de NDMA em inibidores de bomba de prótons, rotâmeros foram observados em GC-MS, levando a erros de até 20% na quantificação se não corrigidos (Fonte: FDA Guidance on Nitrosamine Impurities, 2021). Em LC-MS/MS, solventes como acetonitrila podem induzir rotâmeros em nitrosaminas heterocíclicas, complicando a integração de picos. Ainda, em LC/MS-MS, a fragmentação em MS-MS pode ser influenciada por conformações, alterando padrões de íons ou intensidades, o que é relevante para identificação de nitrosaminas em amostras complexas (e.g., ambientais, farmacêuticas). Estudos toxicológicos de nitrosaminas (como NDMA) frequentemente usam LC/MS-MS para detecção em baixas concentrações, e conhecimentos sobre rotâmeros ajudam a interpretar dados de estabilidade ou reações

Um artigo no Analytical Chemistry (Vol. 93, 2021) discute como rotâmeros em nitrosaminas interferem em GC-MS, recomendando condições isotérmicas para minimizar separação. Estudos de validação mostram que sem correção, o erro relativo pode exceder 15%.

Como saber quando uma Nitrosamina terá Rotâmeros

Identificar antecipadamente se uma nitrosamina apresentará rotâmeros é chave para otimizar análises. Isso depende da estrutura molecular e pode ser previsto por cálculos teóricos ou observado experimentalmente.

Critérios para Identificação

• Estrutura Química: Nitrosaminas com grupos alquila assimétricos (ex.: N-etil-N-metilnitrosamina) ou heterocíclicas (ex.: N-nitrosopirrolidina) têm maior probabilidade de rotâmeros devido a interações estéricas. Em contraste, nitrosaminas simétricas como NDMA raramente exibem esse fenômeno.

• Cálculos Teóricos: Use DFT para calcular barreiras de rotação. Se >8 kcal/mol, rotâmeros são prováveis. Softwares como Gaussian ou ORCA são úteis para modelagem molecular.

• Espectroscopia: NMR (Nuclear Magnetic Resonance) é a técnica padrão para detectar rotâmeros, mostrando sinais duplicados para prótons equivalentes. Em MS, fragmentação diferente pode indicar conformeros.

• Análise Cromatográfica Preliminar: Testes em diferentes temperaturas ou solventes revelam picos múltiplos. Se a barreira for baixa, use derivatização para estabilizar um conformero.

Segundo o ICH Q3A Guideline (International Council for Harmonisation), avaliações estruturais devem incluir previsões de conformeros. Um estudo no Journal of Chromatography A (Vol. 1621, 2020) usa DFT para prever rotâmeros em nitrosaminas, correlacionando com dados experimentais.

Implicações e Estratégias de Controle

Rotâmeros não apenas complicam análises, mas também impactam a conformidade regulatória, potencialmente levando a recalls se quantificações forem imprecisas.

Estratégias incluem:

• Otimização Analítica: Use temperaturas controladas ou solventes que promovam interconversão rápida. Em GC-MS, rampas de temperatura suaves ajudam.

• Correção de Dados: Aplique fatores de correção baseados em proporções de rotâmeros ou use integração total.

• Validação de Métodos: Inclua testes de robustez para rotâmeros, conforme USP <1225> (Validation of Analytical Procedures).

Diretrizes da EMA (2020) enfatizam a necessidade de métodos robustos contra interferências conformacionais.

Conclusão

Rotâmeros em nitrosaminas representam um desafio técnico em análises farmacêuticas, mas com conhecimento aprofundado, podem ser gerenciados. Entender sua formação, interferências e identificação é essencial para garantir quantificações precisas e conformidade com regulamentações globais.

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Referências:

- Eliel, E. L., et al. (2010). Conformational Analysis of Organic Compounds. Wiley.

- FDA Guidance for Industry: Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs (2021).

- EMA Guideline on Nitrosamine Impurities (2020).

- Artigos científicos: J. Am. Chem. Soc. (2020), Anal. Chem. (2021), J. Chromatogr. A (2020).